[Orador 1]: Un sistema más novedoso o moderno, hasta el uso de las técnicas de cultivo in vitro para multiplicación de plantas leñosas. El sistema consiste o se basa en que al separar un meristemo de la planta madre mientras está sobre su planta madre, la planta le proporciona azúcares, vitaminas, hormonas, etc. Pero al separarlo de la planta madre desaparece ese aporte y la idea es sustituir a esa planta que el meristemo tiene debajo por un medio de cultivo naturalmente esterilizado para que no haya infecciones para que le proporcione lo que la planta le proporcionaría y permita su desarrollo La gran dificultad de los sistemas de cultivo in vitro es que los sistemas tradicionales de propagación sean de semillas o sean métodos de multiplicación vegetativa requieren muy pocos medios mientras que los sistemas de cultivo in vitro no se pueden hacer chapuceando. Hay que disponer de unas instalaciones más o menos sofisticadas, pero costosas, porque si no, no hay posibilidad ninguna de funcionamiento. Entonces, las instalaciones necesarias se pueden concretar en dos, un local y un invernadero. En el local se dispondrá de una oficina, de una cocina, de una sala de siembra, de cámaras de cultivo y de uno o varios almacenes La utilidad de cada uno de esos locales es, en la oficina se llevará la administración del vivero sirve para la atención al cliente, en la cocina se preparan los medios de cultivo y se esterilizan los medios de cultivo, los recipientes, herramientas de trabajo. En la sala de siembra se procede a la siembra y a los trasplantes. En las cámaras de cultivo es donde se lleva a cabo el cultivo de los explantos y en el almacén sirven para guardar material, productos químicos, etcétera. Todo esto es muy importante y muy sofisticado y muy llamativo, pero es tan importante o más disponer de un invernadero para la aclimatación de las plantas procedentes de cultivo in vitro, donde han recibido todos y más si hubiera de los cuidados necesarios y no pueden pasar de ninguna forma al aire libre porque se mueren. De modo que es muy importante la aclimatación para asegurar la supervivencia de un alto porcentaje de esas plantas que por otro lado son muy costosas Entonces se puede eso, en fin, de alguna forma gráfica, diciendo que hace falta una oficina, o sea, siembra, cocina, sala de cultivo y almacén. ¿Qué es lo que hay en la cocina? Pues en la cocina hay poco más o menos lo que hay en una cocina. Hay un microondas para calentar cosas, hay una balanza, probablemente de más precisión que la de una cocina normal, hay una nevera para guardar medios de cultivo, incluso botes con plantas, hay una autoclave, bueno, en las cocinas también hay una autoclave, que es la olla a presión, pero esta es más grande y más sofisticada para esterilizar medios de cultivo, y hay un destilador para producir agua bidestilada, a ser posible, porque cualquier impureza que lleve el agua pone en riesgo el éxito del cultivo, y eso sería lo que tiene la cocina. ¿De qué se componen los medios de cultivo? Pues los medios de cultivo se componen de sales minerales, de vitaminas, de hormonas, de azúcares y todo eso compone el medio, digamos, nutritivo. Pero luego hace falta un agente gelificante para asegurar que el explanto se sujeta, no se hunde. ¿Cómo se preparan las soluciones madres? Las soluciones madres se preparan pesando la cantidad correspondiente a una concentración, por ejemplo, 10 veces superior a la definitiva para luego diluirla, que se disuelve con agua bidestilada. Una vez que está eso preparado, se coloca en un frasco, a ser posible de color topacio, para que no le dañen los rayos de ultravioleta y se guarda en una cámara frigorífica para su conservación. Las sales minerales se pueden agrupar de forma correcta en dos grupos, en macroelementos y microelementos. Y esta es la variedad de posibilidades que, por fortuna, estos dos investigadores Mureshige y Skug, ya hace tiempo, diseñaron y encontraron una fórmula que podríamos llamar universal, que con pocas variaciones sirve para muchísimas plantas, en cuanto a contenidos de macroelementos y de microelementos. Normalmente las soluciones madres se preparan 10 veces más concentradas y suelen llevar nitrato amónico, cloruro cálcico, sulfato magnésico, nitrato potásico, nitrato monofosfato potásico, y como microelemento ácido bórico, cloruro de cobalto, sulfato de cobre, sulfato de hierro, sulfato de manganeso, y yoduro potásico, la sal sódica del EDTA, molidato sódico y sulfato de zinc. Las vitaminas que se suelen utilizar no son todas las mismas ni en las mismas proporciones, pueden ser ácido aminobenzoico, ácido ascórbico, biotina, pantotenato cálcico, cianocobalamina, ácido fólico, ácido nicotínico, riboflavina y clorhidrato de diamina, que son lógicamente todas vitaminas hidrosolubles. En cuanto a las hormonas, se suelen utilizar ácido anacético, ácido anastaleno acético, benciladenina, bencilaminopurina y ceatina. De modo que eso así preparado, para preparar un medio de cultivo, se comienza con un protocolo adecuado, tomando la cantidad necesaria para completar el volumen que se desea de macroelementos, de las madres de macroelementos, de la solución madre de microelementos, vitaminas, hormonas y por ese orden. Y a continuación se completa con agua destilada hasta el volumen que se desea. Y a continuación se averigua el pH de la solución que tenemos. Y si no es la correcta, se corrige con alguna gotita de ácido clorhídrico o de hidróxido potásico en solución normal. Hasta alcanzar pH del orden de 5,5 o 6,5 según la receta que se vaya a utilizar. A continuación se añaden los azúcares. se disuelve y nos faltaría solamente añadir el agar. Pero el agar, que se emplea con frecuencia como agente gelificante, no se disuelve en frío y es merecer calentarlo, por lo cual se utiliza un microondas que se programa a 40-45 grados durante el menor tiempo posible para que se destruyan lo menos posible las vitaminas y las hormonas. Paso ese tiempo, el líquido aparece claro y se encapsula en los botes correspondientes y queda preparado a su uso nutritivo. Si se va a tardar en utilizarlo, se puede meter en frigorífico. La esterilización de los medios de cultivo se hace en autoclave. Los medios de cultivo y las herramientas envueltas en papel de aluminio, en este caso, se introducen en autoclave lo mismo que frasco con agua destilada que sirve para lavar después de, por ejemplo, la esterilización. o la desinfección. Se cierra la autoclave, se programa a 115 o 125 grados que corresponden a 1,1 atmósfera durante 10-15 segundos y lo importante es que siempre sea igual para que no cambien las condiciones concretamente de degradación de vitaminas y de hormonas. Pasar ese tiempo y cuando se ha alcanzado una atmósfera de temperatura se puede abrir, sacar lo que hemos metido y quedaría esterilizado lo que son medios, herramientas y frascos por dentro. En el momento de abrirlas se contaminan por fuera. En cuanto al material vegetal no se puede esterilizar porque se cocería, lógicamente, y la única solución es desinfectarlo utilizando hipoclorito de calcio o hipoclorito sódico, mejor de calcio, durante 10 minutos o un cuarto de hora agitándolo y a continuación darle tres lavados sucesivos con agua bidestilada esterilizada. con lo cual eliminamos los restos de hipoclorito y tenemos el material dispuesto para la siembra. La sala de siembra es una habitación cerrada, sin ventanas, para que haya menos posibilidad de contaminación, y en las cuales hay colocadas una o dos, en fin, las que sean necesarias, mesas de cultivo, que es donde se llevan a cámara a cabo las transferencias a los frascos de cultivo. Eso se llaman cámaras de siembra de flujo laminal, Tienen instalado uno o varios tubos fluorescentes de rayos ultravioleta germicidas para, encendiéndolos con tiempo suficiente, esterilizar las superficies a las que toca y tiempo antes de abrir la puerta, se apagan, lógicamente pueden producir quemaduras Y una de las madres del cordero es la utilización de cámaras de flujo laminar, que consisten en unas mesas amplias que permiten trabajar con comodidad, que tienen en la parte posterior un turboventilador que manda aire a través de un filtro microbiano y pasan por fin por una rejilla donde sale el aire en flujo laminar muy despacio y echando hacia afuera las posibles esporas que pudieran caer del exterior. También disponen las mesas de flujo laminar de unas tubos fluorescentes germicidas para, antes de ponerse a trabajar, ponerlo en marcha. Y dentro de la cámara hay siempre un mechero encendido para flamear los instrumentos que han de tocar los esplantos en las operaciones de siembra y de transferencia. Las salas de cultivo son unas habitaciones tan grandes como sean necesarias, provistas de estanterías que están climatizadas, frío y calor, para mantener temperaturas óptimas y que tienen baterías de tubos fluorescentes de una calidad de luz que se llama Corollux, que es la más parecida a la luz del sol, bajo los cuales se colocan los frascos de cultivo para su desarrollo. Ahí se mantiene una intensidad de luz adecuada y un fotoperiodo que puede ser normalmente de 16 horas de luz y 8 de oscuridad, y así las plantas normales, salvo excepciones, funcionan mejor que con iluminación continua. Luego en las salas de cultivo es donde se produce el desarrollo de los explantos y una vez que está conseguida la planta completa hay que proceder a su aclimatación, porque si directamente de ahí lambeamos al campo, pues obviamente se mueren, si no todas, pues todas. De manera que hay que proceder a su aclimatación pasándolas previamente por un invernadero en donde están plantadas en bandejas, se aclimatan sometiéndolas a ambientes al principio bastante oscuros, con temperaturas bastante altas y humedad relativa muy alta, para ir pasando gradualmente a condiciones de temperaturas más bajas y humedad relativa más baja. Una vez que han pasado por esa fase, pueden pasar con suficiente garantía a campo abierto para su crianza posterior. Un ejemplo de planta leñosa son los híbridos de melocotón-almendro que se cultivan in vitro para obtener patrones para ser utilizados luego en el cultivo del almendro y del melocotón Entonces el protocolo es utilizando meristemos como primer explanto conseguir en la fase de implantación que de un brote sin raíces a continuación se transfiere a otro medio en donde se propicia su ahijamiento, después se pasa a otro medio que promueve su alargamiento, y por último, a independizados, se pasa a un medio de enraizamiento. Y los medios de cultivo son, curiosamente, siempre los mismos, a diferencia de las hormonas. En el primero de ahijamiento se utiliza ácido azanero acético, A razón de 0,01 miligramos por litro, bencila aminopurina 0,6 y ácido gibralérico 0,1, en la fase de alargamiento se esfuerza el ácido naltaleoacético y en la fase de enraizamiento se elimina la bencila aminopurina y el ácido gibralérico que son inhibidores.